GFP的發(fā)光原理

在我們選擇熒光蛋白時(shí)，首要考慮的是熒光蛋白的聚合性質(zhì)，即是否會(huì)影響目的蛋白的功能及定位，其次是熒光蛋白的 PK 值是否與目的蛋白所處的環(huán)境的 pH 值相匹配，然后是熒光蛋白的成熟時(shí)間以及目的蛋白的壽命，綜合兩者決定熒光蛋白是否合適，zui后考慮熒光蛋白的光穩(wěn)定性、密碼子偏好性是否合適，zui后考慮目的蛋白放的位置，熒光蛋白是否會(huì)影響目的蛋白的功能及定位。

發(fā)光原理：
GFP的第65至67位的三個(gè)氨基酸（絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸）殘基，可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團(tuán)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)鏈折疊時(shí)，這段被深埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸片段，得以“親密接觸"，導(dǎo)致經(jīng)環(huán)化形成咪唑酮，并發(fā)生脫水反應(yīng)。在分子氧存在的條件下，發(fā)色團(tuán)可進(jìn)一步發(fā)生氧化脫氫，zui終成熟，形成可發(fā)射熒光的形式。具體過(guò)程為：在 O2存在下，GFP分子內(nèi)第67位甘氨酸的酰胺對(duì)第65位絲氨酸的羧基進(jìn)行親核攻擊，形成第5位碳原子咪唑基；第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應(yīng)之后，導(dǎo)致芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合，并zui終自發(fā)催化形成對(duì)羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色。

GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便立即得到恢復(fù)。一般來(lái)說(shuō)弱還原劑并不會(huì)影響GFP熒光，中度氧化劑如生物材料的固定，脫水劑戊二酸或甲醛等對(duì)GFP熒光影響也不大。

發(fā)光特性：
GFP吸收的光譜zui大峰值為395nm（紫外），并有一個(gè)峰值為470nm的副吸收峰（藍(lán)光）；發(fā)射光譜zui大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰（Shouder）。雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發(fā)光對(duì)細(xì)胞的傷害更小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。此外，GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽（FITC）很相似，兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強(qiáng)，特別是在450～490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定。類似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強(qiáng)，因此更適用于定量測(cè)定與分析。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白，其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白的。但因?yàn)镚FP不是酶，熒光信號(hào)沒(méi)有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白，比如螢火蟲(chóng)熒光素酶等