轉(zhuǎn)基因玉米熒光現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè)方法

  近日，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院發(fā)表文獻(xiàn)，利用LUYOR-3415RG便攜式熒光蛋白激發(fā)光源對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗的可視化檢測(cè)。文獻(xiàn)摘要如下：

轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 具有良好的抗蟲(chóng)性和除草劑耐受性，是我國(guó)批獲得安全證書(shū)的轉(zhuǎn)基因 玉米之一，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究利用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）建立轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法。

針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 的轉(zhuǎn) 化體特異性序列片段，設(shè)計(jì)引物和探針，通過(guò)引物篩選實(shí)驗(yàn)得到更佳引物與探針組合。熒光 RPA 擴(kuò)增 結(jié)果可以在藍(lán)光（LUYOR-3415RG）下直接進(jìn)行可視化分析。結(jié)果表明，建立的轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 可視化檢測(cè)體系特異 性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到 10 拷貝。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) RPA 的擴(kuò)增體系對(duì)溫度有很強(qiáng)的適應(yīng)性，樣品在 34℃ ~46℃之間都能得到擴(kuò)增，據(jù)此，本研究利用市面上常見(jiàn)的自發(fā)熱暖貼代替常規(guī)的加熱儀器來(lái)激發(fā) RPA。 結(jié)果表明，自發(fā)熱暖貼滿足 RPA 擴(kuò)增體系對(duì)溫度的需要。

最終，本研究將自發(fā)熱暖貼加熱法與 RPA 可 視化檢測(cè)體系結(jié)合，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，并與 qPCR 方法檢測(cè)結(jié)果作比較，檢測(cè)結(jié)果表明，本研究建立的現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè)方法與 qPCR 方法檢測(cè)結(jié)果一致，并且可視化檢測(cè)方法時(shí)間短， 檢測(cè)結(jié)果清晰易分辨。本研究建立的轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 現(xiàn)場(chǎng)快速可視化檢測(cè)方法，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便、快捷，不僅滿足了轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要，也為其他現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)提供了新思路。

1 材料與方法 

1.1 材料 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 種子，轉(zhuǎn)基因玉米 NK603、BT176、T25 和 BT11，轉(zhuǎn)基因大豆 A5547-127、356043、GTS40-3-2 和 FG72，轉(zhuǎn)基因油菜 MS1×RF1、MS2×RF2、MS8×RF3 和 OXY235，轉(zhuǎn)基因棉花 LLcotton25、MON15985 和 GHB119 的 DNA 均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。 

1.2 DNA 提取 按照植物 DNA 提取試劑盒（杭州新景生物試劑開(kāi)發(fā)有限公司）說(shuō)明書(shū)提取各樣品的基 因組 DNA，所提取的 DNA 用核酸蛋白測(cè)定儀 NanoDrop2000C（美國(guó) Thermo 公司）進(jìn)行核 酸質(zhì)量分析，并置于-20℃貯存?zhèn)溆谩?nbsp;

1.3 熒光 RPA 參照 RPA（熒光型）試劑盒（濰坊安普未來(lái)生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體系配置， 熒光 RPA 反應(yīng)體系為 50 μL：Buffer A 12.5 μL，10 μmol/L 正、反向引物各 2 μL，10 μmol/L 探針 0.6 μL，模板 DNA 2 μL，加 ddH2O 補(bǔ)齊到 47.5 μL，充分混勻后加入 Buffer B 2.5 μL， 再次混勻。熒光 RPA 反應(yīng)條件：39℃擴(kuò)增 20 min。熒光 RPA 的實(shí)時(shí)熒光信號(hào)用熒光定量 PCR 儀 CFX96（美國(guó)伯樂(lè)公司）觀察，熒光 RPA 的可視化結(jié)果用手持藍(lán)光燈（LUYOR-3415RG，路陽(yáng)儀器）照射并在黃色濾鏡下拍照觀察。 

1.4 引物與探針設(shè)計(jì) 熒光 RPA 體系包括 2 條引物和 1 條探針，轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 的載體示意圖及擴(kuò)增的 轉(zhuǎn)化體特異性序列信息見(jiàn)圖 1A。利用 Vector NTI 軟件在外源插入位點(diǎn)的左側(cè)即轉(zhuǎn)基因玉米 基因組序列設(shè)計(jì)上游引物 8 條，在外源插入位點(diǎn)的右側(cè)即外源插入片段序列設(shè)計(jì)下游引物 8 條。所設(shè)計(jì)的上、下游引物分別處于外源插入位點(diǎn)的兩側(cè)，以保證對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 的 特異性擴(kuò)增。引物長(zhǎng)度 30~35 bp，GC 含量占 30%~70%[13]。所設(shè)計(jì)探針包含玉米基因組和 外源片段的序列，長(zhǎng)度 46~52 bp，并避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)重復(fù)堿基。探針共 有 4 個(gè)修飾位點(diǎn)，在距離 5'端中間部位，第 31 個(gè)堿基 G 處標(biāo)記一個(gè)四氫呋喃（THF）堿基 類似物，作為核酸外切酶的識(shí)別位點(diǎn)；在 THF 位點(diǎn)的上游，第 30 個(gè)堿基 T 處標(biāo)記一個(gè)熒光 基團(tuán)（FAM:6-羧基熒光素），在 THF 位點(diǎn)的下游，第 33 個(gè)堿基 T 處標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（BHQ: 熒光猝滅基團(tuán)），兩基團(tuán)的間距為 1~5 bp；THF 位點(diǎn)距離 3'末端至少 15 bp 長(zhǎng)度，并在 3'末 端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)。只有當(dāng)探針與序列成功配對(duì)時(shí)，THF 位點(diǎn)才會(huì)被外切酶切割，使熒光 基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)（圖 1B）。 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 的普通 PCR 引物和 qPCR 引物引用標(biāo)準(zhǔn)[14]，本研究所用的引 物和探針配制為 10 μmol/L。所有引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成， 引物和探針信息見(jiàn)表 1。 

1.5 引物篩查 用上游引物 F1 分別與所有下游引物組合，結(jié)合探針，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 進(jìn)行實(shí)時(shí) 熒光 RPA 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，分析結(jié)果，選出其中擴(kuò)增效率更高的下游引物，再用這條下游引物分 別與所有上游引物組合，結(jié)合探針，對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 RPA 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)， 選擇擴(kuò)增效率更高的一組，作為最終的檢測(cè)引物組合。

RRC平臺(tái)實(shí)樣現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)

為評(píng)估RRC平臺(tái)在真實(shí)樣品現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的適用性，以96顆大豆的96片葉片作為真實(shí)樣品。一個(gè)簡(jiǎn)短的工作流程展示在圖 3A. 所有 DNA 均通過(guò) RDEM 提取，并用作 RT-PCR 和 RAA 的模板。RRC平臺(tái)的視覺(jué)熒光結(jié)果表明，從96個(gè)樣品中檢測(cè)到22個(gè)SHZD32-1。帶有SHZD32-1的試管中呈現(xiàn)亮綠色熒光。因此很容易與其他沒(méi)有 SHZD32-1 的管區(qū)分開(kāi)來(lái)（圖 1B）。此外，使用熒光成像系統(tǒng)（ChemiDoc Imaging System，Bio-Rad，美國(guó)）分析 RRC 平臺(tái)的 96 孔板。在這些管中觀察到白色熒光（圖 1B）。這一結(jié)果意味著手持熒光燈(LUYOR-3415RG)的可視化結(jié)果可以與大型專業(yè)儀器的觀察結(jié)果相媲美。此外，RRC平臺(tái)和RT-PCR的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果一致。96份樣本經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，同樣22份樣本為SHZD32-1，22份樣本的Ct值與擴(kuò)增曲線一起給出（圖 1C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，RRC 平臺(tái)對(duì)于目標(biāo)核酸的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)具有高度的準(zhǔn)確性。

文獻(xiàn)全文下載地址：

Frontiers | A Fast, Visual, and Instrument-free Platform Involving Rapid DNA Extraction, Chemical Heating, and Recombinase Aided Amplification for On-Site Nucleic Acid Detection | Bioengineering and Biotechnology (frontiersin.org)

LUYOR-3415RG便攜式熒光蛋白激發(fā)光源產(chǎn)品介紹：